觀察GFP和包括FITC在內(nèi)的綠色熒光，都可以使用nightsea的體視顯微鏡熒光適配器(Stereo Microscope Fluorescence Adapter)，這毫無問題。我們經(jīng)常遇到的問題是：是用下圖中黃色的longpass濾光片好呢？還是選擇綠色的bandpass濾光片好。

答案是：不能一概而論，常要視具體情況來做出選擇。下文分析一下兩者各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

  Longpass：可以透過任何超過~500nm波長(zhǎng)的光

  Bandpass：透光波長(zhǎng)以~530nm為中心，透光波長(zhǎng)范圍約~60nm。

就是說bandpass只能透過綠色光，而longpass可以透過的光包括了綠，黃，橙和紅色。

濾光片有何作用？

濾光片就是用來強(qiáng)化預(yù)觀察的熒光信號(hào)的：它能擋住(源于激發(fā)光源的)反射光，同時(shí)透過我們想觀察的熒光信號(hào)。在實(shí)際觀察中常常受到來自觀測(cè)區(qū)域內(nèi)其它潛在熒光信號(hào)的干擾（噪音），這類背景熒光信號(hào)可能來自培養(yǎng)基（線蟲研究中常會(huì)有此問題），或是其它東西（例如植物葉綠素和發(fā)育中的斑馬魚的yolk發(fā)出的熒光信號(hào)）。

Longpass和bandpass在阻擋激發(fā)光上都沒有問題。問題焦點(diǎn)是面對(duì)這些噪音信號(hào)，兩者中哪個(gè)才是正確的選項(xiàng)？

如果背景信號(hào)和你要觀察的信號(hào)在波長(zhǎng)上不存在重疊，那應(yīng)該選擇bandpass濾光片。如下圖所示，擬南芥（或其它植物）的葉綠素發(fā)出紅色熒光，其波長(zhǎng)峰值約為685 nm，bandpass可以將它過濾掉，這樣就可以輕松觀察GFP信號(hào)而不再受到它的干擾（*張顯示longpass濾光片下存在信號(hào)疊加，第二張bandpass下只余下綠色熒光）。

擬南芥圖片由波士頓大學(xué)John Celenza博士惠贈(zèng)。

更多圖片鏈接：http://www.nightsea。。ｃｏｍ/articles/green-bandpass/

但是，在所要觀察的熒光信號(hào)與背景信號(hào)波長(zhǎng)存在交叉疊加時(shí)，將背景信號(hào)過濾掉則可能引起問題。這時(shí)，使用longpass濾光片保留背景信號(hào)更好：可以通過信號(hào)的強(qiáng)度和顏色的對(duì)比來區(qū)分（哪是要觀察的熒光信號(hào)，哪是背景信號(hào)）。下面是一條轉(zhuǎn)熒光基因的斑馬魚圖片。這條斑馬魚在心臟表達(dá)GFP，在血細(xì)胞表達(dá)mCherry。Longpass（上端）就可以將此區(qū)分出來，而bandpass（下端）就不能。上端圖像可以呈現(xiàn)出清晰的綠色熒光心臟，紅色熒光血細(xì)胞，還有yolk天然發(fā)出的黃色熒光。而在選擇bandpass濾光片所獲的圖像里，滿眼是強(qiáng)弱不等的綠色，這些綠色并不全是來自GFP的表達(dá)，因此容易造成混亂和誤判。

斑馬魚圖片由Williams大學(xué)Martha Marvin博士惠贈(zèng)，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚由Buffalo大學(xué)Lara Hutson博士雜交培育。

有的情況下，則兩種濾光片都可以。線蟲培基可以呈現(xiàn)綠色熒光背景，同樣是面對(duì)這一場(chǎng)景，有的觀測(cè)人員傾向使用bandpass，有的傾向用longpass，前者認(rèn)為bandpass比longpass增加了一些清晰度和對(duì)比度?？傊鎸?duì)此種情景，個(gè)人偏好在zui終選擇上起了關(guān)鍵作用。

如果是探索自然界的熒光信號(hào)，那沒有疑問，應(yīng)該選擇longpass。選擇bandpass的話，你可拍不出下圖藿香薊花的美妙來！

該文英文由Nightsea提供

http://www.nightsea。。ｃｏｍ/sfa-sharing/longpass-vs-bandpass-barrier/

該文由群曉科苑翻譯，群曉科苑為nightsea授權(quán)代理商。

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